Células dendríticas especializadas en presentación de antígenos exógenos a linfocitos T citotóxicos
Specialized dendritic cells in cross-presentation of exogenous antigens to cytotoxic T lymphocytes
C. Alfaro1, C. Oñate1, A. Rodríguez1, J.L. Pérez-Gracia2, M. Fernández de Sanmamed1,2, I. Melero1,2
Resumen
Las células dendríticas son células de origen hematopoiético, que expresan constitutivamente moléculas presentadoras de antígeno MHC de clase I y II, y son funcionalmente las inductoras más potentes de la activación y proliferación de linfocitos T a los que presentan antígenos. Los linfocitos T CD8+ proliferan y adquieren capacidad citotóxica cuando reconocen su antígeno específico presentado en la superficie de una o varias células dendríticas con las que interactúan. Sin embargo, solamente algunas subpoblaciones de células dendríticas pueden presentar antígenos internalizados desde el exterior celular a través de procesos de pinocitosis y fagocitosis a precursores de linfocitos T citotóxicos. Esta función se denomina presentación cruzada o presentación subrogada (en inglés, crosspresentation) y requiere mecanismos de translocación de los antígenos que se encuentran internalizados en fagosomas al citosol para su procesamiento. Se ha establecido que la diferenciación de subpoblaciones de células dendríticas con capacidad de efectuar este tipo de presentación cruzada a linfocitos T CD8+ son dependientes del factor de crecimiento FLT-3L y del factor de transcripción BATF3. Presentan peculiaridades tanto funcionales como de marcadores de membrana que nos permiten identificarlas. En ratones se distinguen por la expresión de CD8? y en humanos por la de CD141 (BDCA-3). Esta población en ambas especies es capaz de internalizar selectivamente restos de células necróticas mediante su receptor CLEC9A que se une a actina polimerizada extracelular. Disponen del receptor de quimioquinas XCR1 que asegura su encuentro con linfocitos T CD8+. La vacunación terapéutica con antígenos tumorales utilizando células dendríticas es una estrategia en desarrollo para el tratamiento del cáncer. La utilización de subpoblaciones de células dendríticas con mayor capacidad de realizar presentación cruzada o subrogada remeda los mecanismos naturales de inmunización para inducir linfocitos T citotóxicos. La dianización in vivo de antígenos a estas subpoblaciones celulares mediante anticuerpos monoclonales anti-DEC-205 o anti-CLEC9A consigue respuestas inmunitarias muy intensas y se están probando en ensayos clínicos frente a viriasis crónicas y enfermedades malignas.
Palabras clave. Células dendríticas. Presentación cruzada/Presentación subrogada. CD8-alfa. BDCA-3. CLEC9A.
Abstract
Dendritic cells (DC) are cells of hematopoietic origin, which constitutively express MHC class I and II, and are functionally the most potent inducers of T-lymphocyte activation and proliferation. CD8+ T lymphocytes proliferate and acquire cytotoxic functions upon recognition of their cognate antigen on the surface of one or various dendritic cells with which they interact. However, only some DC subsets are able to present antigen to cytotoxic T cell precursors as taken up from extracellular sources. This function is termed cross-presentation (in Spanish, presentación cruzada or presentación subrogada) and requires shuttle mechanisms from phagosomes to the cytosol for antigen processing. It has been demonstrated that the differentiation of DC with these capabilities is dependent on FLT-3L and the transcription factor BATF3. They express peculiar functions and differentiation markers. These cells are distinguished in mice by surface CD8? features, while CD141 (BDCA-3) marks these cells in the human. These subpopulations are capable of selective internalization of necrotic cell debris by means of their CLEC9A lectin which is a receptor for extracellular polymerized actin. Expression of the chemokine receptor XCR1 favours contact with CD8+ T cells. Therapeutic vaccination with tumour antigens using DC is a strategy under development for the treatment of cancer. The use of DC subsets with more prominent capabilities for cross-presentation would mimic the natural mechanisms of immunization to induce cytolitic T lymphocytes. In vivo targeting of antigens with monoclonal antibodies against DEC-205 or CLEC9A attains very robust immune responses and is a strategy undergoing clinical trials for chronic viral diseases and malignancies.
Key words. Dendritic cells. Cross-presentation. CD8-alpha. BDCA-3. CLEC9A.
1. Área de Terapia Génica y Hepatología. Centro de Investigación Médica Aplicada. Universidad de Navarra. Pamplona.
2. Departamento de Oncología Médica. Clínica Universidad de Navarra. Universidad de Navarra. Pamplona.
Recepción: 19 de junio de 2013
Aceptación provisional: 3 de septiembre de 2013
Aceptación definitiva: 11 de septiembre de 2013
Correspondencia:
Ignacio Melero
Clínica Universidad de Navarra (CUN)
Centro de Investigación Médica Aplicada (CIMA)
Avda. Pio XII, 55
31008 Pamplona
imelero@unav.es
Células dendríticas
Las células dendríticas fueron observadas por primera vez en la piel por el histólogo alemán Paul Langerhans a finales del siglo XIX. Sin embargo la función inmunológica de las células de Langerhans de la piel pasó inadvertida durante al menos siete décadas. El término célula dendrítica (CD) no fue utilizado hasta 1973, por R. M. Steinman y ZA. Cohn, y deriva del hecho de que estas células tienen prolongaciones que remedan la morfología de las dendritas neuronales. Los estudios de Steinman definieron las CD, observando aquellas que ahora clasificamos en el subgrupo de CD mieloides o convencionales. Sus estudios postularon las CD como una población celular minoritaria de órganos linfoides caracterizada morfológicamente por múltiples prolongaciones en forma de ramas (dendritas) y que era capaz de activar linfocitos T sin experiencia antigénica previa1-3. Por estos descubrimientos le fue otorgado el premio Nobel de medicina en 2011, galardón que premiaba una larga trayectoria de descubrimientos dedicada a esclarecer paulatinamente la relevancia de estas células en la fisiología del sistema inmunitario4,5. El profesor Steinman no llegó a conocer la concesión de este galardón ya que falleció dos días antes de que le fuera comunicada la noticia (Fundación Nobel, http://www.nobelprize.org/).
Las CD, según Steinman, son los «centinelas naturales del sistema inmune», siendo las encargadas de decidir si se induce o si no se pone en marcha una respuesta inmunitaria adaptativa ante la invasión de gérmenes patógenos6. Las CD derivan de precursores hematopoyéticos y son principalmente de linaje mieloide, aunque se ha puesto de manifiesto su plasticidad ontogénica7. A menudo, aunque no siempre, presentan una morfología con prolongaciones celulares retráctiles que les permiten aumentar la superficie para establecer contactos intercelulares8.
Al ser las principales células profesionales presentadoras de antígeno, son importantes tanto en la estimulación/activación como en la regulación de la intensidad de la respuesta de linfocitos T y linfocitos B9. Se postula que, en ausencia de estímulos microbianos o inflamatorios, las CD permanecen en estado de reposo (llamado inmaduro), en el cual su capacidad de activación de linfocitos T se encuentra activamente reprimida10. La exposición de las CD a agentes infecciosos provoca varios cambios funcionales y de expresión génica, los cuales en forma coordinada, mejoran notoriamente su capacidad para interactuar con los linfocitos T a los que presentan antígeno y promover tanto su proliferación como su diferenciación funcional11. El término maduración de células dendríticas se utiliza para referirnos a esta activación funcional, que se plasma en la puesta en marcha de un programa de expresión génica y en la modificación de su patrón de migración en respuesta a estímulos quimiotácticos, merced a cambios en la expresión de receptores de quimioquinas12.
En el estado inmaduro, las CD están especializadas en internalizar material potencialmente antigénico tanto exógeno al organismo como endógeno (procedente principalmente de detritus celulares) y para ello poseen una maquinaria de endocitosis muy eficiente13. La captación de antígenos está facilitada por receptores endocíticos de superficie14, tales como: receptores para el Fc de las inmunoglobulinas (CD32), receptores de complemento, integrinas, receptores tipo lectina C (CD209, CD205, BDCA, langerina, receptores de manosa) y receptores tipo scavenger (LOX-1, CD91, CD36).
En el estado inmaduro, las CD muestran escasa densidad en su superficie de moléculas presentadoras de antígeno del complejo mayor de histocompatibilidad de clase I y II (MCH-I y MHC-II) y de moléculas co-estimuladoras (CD40, CD80 y CD86). Por el contrario su superficie es rica en receptores implicados en captación de antígeno por endocitosis, fagocitosis y, sobre todo, macropinocitosis, tales como los receptores para el Fc de inmunoglobulina, de manosa y para factores activados del complemento.
En esta situación de inmadurez (o falta de activación), las CD son capaces de inducir y mantener la tolerancia frente a autoantígenos en tejidos periféricos, ya que continuamente presentan los antígenos propios a los linfocitos T, de manera que en los linfocitos específicos de autoantígenos se induce apoptosis o anergia funcional15. Por tanto, la presentación de autoantígenos por células dendríticas inmaduras en condiciones de normalidad elimina del repertorio de reconocimiento a aquellos clones de linfocitos T potencialmente autoreactivos10.
En el tejido inflamado aumenta considerablemente la capacidad de macropinocitosis de las CD y la expresión de receptores que permiten la captación de antígeno. Asimismo parte de los monocitos que penetran el tejido de novo para formar el infiltrado inflamatorio, se diferencian in situ en células dendríticas16. También se activa la biosíntesis de moléculas de MHC-I y II, que forman complejos con eficiencia tanto con péptidos originados en la propia célula dendrítica como con polipéptidos externos que han captado en el tejido inflamado. Cuando son estimuladas por citoquinas proinflamatorias (TNF-?, IL-1ß, IL-6, INF-?) o por el ligando de CD40 (CD40L), expresado sobre linfocitos T cooperadores (T helper), las CD se activan diferenciándose a CD maduras (CDm). En este estado expresan en la superficie celular CD80 y CD86 con mayor densidad16. Además, las CDm también adquieren la expresión de CD83 en su superficie. Estas glicoproteínas de membrana confieren capacidad para estimular aquellos linfocitos T que reconocen sobre ellas su antígeno específico.
Otra característica de las CDm es su capacidad regulada de secretar IL-1217 y de otras citoquinas activadoras de células T tales como IL-1518,19, IFN-?20,21 o IL-222. La producción de IL-12 está implicada en la inducción de respuestas de linfocitos T helper productores de IFN-y (linfocitos Th1) y en la activación de linfocitos T citotóxicos (CTL) efectores23.
Al madurar, las CD modifican el patrón de expresión de receptores de quimioquinas de forma que se pierde la expresión de CCR1 y CCR5 y así pueden salir del territorio inflamado24. La adquisición de la expresión de CCR7 permite que sean atraídas a vasos linfáticos aferentes para comenzar su recorrido rumbo hacia órganos linfoides secundarios25-27.
Como resultado de su maduración, las CD experimentan un incremento de la estabilidad en la membrana plasmática de sus complejos MHC/péptido y pierden la capacidad de captación y procesamiento de nuevos antígenos. Se piensa que estos cambios disminuyen dicho procesamiento durante la migración a los órganos linfoides secundarios (ganglios linfáticos, bazo, amígdalas o tejido linfoide asociado a mucosas).
Cuando llegan a dichos órganos, las células dendríticas maduras se emplazan en las zonas interfoliculares del paracórtex ricas en células T, donde realizan su función de presentar péptidos antigénicos a aquellas células T específicas que allí se encuentren24. Sin el guiado de las quimioquinas, el encuentro entre el linfocito específico y la célula presentadora sería un fenómeno muy improbable. En una serie de encuentros concertados por quimioquinas y en los que intervienen moléculas de adhesión los linfocitos T rastrean aquellas CD sobre la que su receptor clonotípico de antígeno (TCR) efectúa el reconocimiento específico. El sentido fisiológico de estos fenómenos celulares es que de esta manera se inicie y sostenga la respuesta inmune contra un agente agresor cuyos antígenos han sido captados en un foco inflamatorio24. Esta respuesta implica la multiplicación de los linfocitos T específicos para el antígeno (expansión clonal) y la adquisición de funciones efectoras, proinflamatorias, citolíticas o de cooperación para respuestas de anticuerpos.
Existen dos clases de estímulos que inducen la transformación de las CD en formas inmunológicamente maduras y, por consiguiente, capaces de activar linfocitos T. Uno de ellos consiste en el reconocimiento de patrones moleculares asociados a gérmenes28. Carles Janeway fue el primer inmunólogo en postular que la detección de un antígeno en el contexto de señales moleculares de infección eran críticos para la inducción de respuestas inmunitarias. El otro tipo de estímulos depende de la exposición de las CD a señales endógenas peligrosas, como las sustancias liberadas por células dañadas29-31. La importancia del daño celular fue postulada por Polly Matzinger como un factor crítico en la iniciación de la inmunidad29. Cada vez parece más claro que sustancias endógenas que denotan daño (alarminas) y patrones moleculares de gérmenes (PAMPs) actúan de modo coordinado en la activación de CD32. Existen diferentes tipos de sistemas de receptores que las CD utilizan para reconocer patrones moleculares asociados a gérmenes o a daño celular (derivados de biomoléculas de virus, bacterias, sustancias producidas por células dañadas, etc)23. El receptor toll-like receptor-4 (TLR-4) está implicado tanto en la detección de endotoxina bacteriana como en la de señales moleculares de estréss, tales como la presencia extracelular de la proteína nuclear HMGB133.
Se ha demostrado que según la naturaleza del estímulo madurativo, las CDm pueden modificar sus funciones, adecuando el tipo de inmunidad que despiertan a la naturaleza del agente nocivo que la desencadena. Se ponen en marcha así respuestas linfocitarias con funciones efectoras diversas y especializadas17,34,35. Asimismo, hay distintas líneas experimentales que sugieren que aunque las CD experimentan cambios madurativos en respuesta a citoquinas proinflamatorias, en ausencia de patrones moleculares de gérmenes o daño tisular las señales son insuficientes para capacitarlas de cara a la activación de linfocitos T efectores29.
Se han efectuado numerosos experimentos utilizando CD diferenciadas en cultivos a partir de monocitos de sangre periférica en humanos o de precursores de médula ósea de ratones en presencia de GM-CSF y otros factores de crecimiento36,37. Los monocitos CD14+ o suspensiones celulares de médula ósea son cultivados in vitro en presencia del factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) e IL-438, IFN-?39 o IL-1540, logrando así su transformación en potentes células presentadoras15,23,34,41.
Existe una subpoblación de CD que circula en la sangre y está presente en órganos linfáticos denominada CD plasmocitoide. Su rasgo funcional más llamativo es que producen grandes cantidades de las proteínas antivirales INF-? e IFN-ß en respuesta a la presencia de virus42-44. Las CD plasmocitoides detectan la presencia de RNA de características virales en sus endosomas a través del receptor TLR-745-47. El papel de estas células en presentación antigénica ha sido controvertido, pero en artículos recientes se ha demostrado su capacidad de presentar antígeno tanto a linfocitos T CD4 y CD8 en las condiciones adecuadas48,49.
El fenómeno de la presentación cruzada o subrogada a linfocitos T citotóxicos
Los fenómenos bioquímicos de proteolisis y ensamblaje en moléculas presentadoras de antígeno se conocen como procesamiento antigénico e implican la degradación de los antígenos proteicos a péptidos más cortos. Estos péptidos son adsorbidos en moléculas de presentación antigénica del complejo principal de histocompatibilidad y así son dispuestos para su presentación en la membrana plasmática50. La presentación antigénica es el conjunto de fenómenos y mecanismos que hacen accesible en la membrana de la célula presentadora de esos péptidos asociados a moléculas MHC para su reconocimiento por parte de los linfocitos T50.
Las células implicadas en el proceso de presentación de antígeno son, por un lado, las células presentadoras que muestran en su membrana los complejos MHC-antígeno y, por otro, los linfocitos T que aportan sus receptores específicos de antígeno denominados TCRs, que son capaces de reconocer el péptido antigénico en asociación a una molécula presentadora propia51. La activación de la célula T no sólo exige que exista un reconocimiento molecular entre el complejo MHC-antígeno y el TCR, sino que también requiere un conjunto adicional de interacciones entre las proteínas de membrana de ambas células y de factores solubles paracrinos (citoquinas).
Dependiendo del tipo de antígeno y de la ruta de procesamiento los antígenos pueden presentarse asociados a moléculas de clase I (MHC-I) o moléculas de clase II (MHC-II), lo que permitirá el reconocimiento antigénico por subpoblaciones diferentes de linfocitos51. Todas las células nucleadas expresan moléculas de MHC de clase I en su membrana, pero solo las células presentadoras de antígeno (APC) especializadas presentan moléculas de MHC de clase II y, en condiciones normales, incluyen los macrófagos, las CD y los linfocitos B activados. A estas células que expresan MHC de clase II las denominamos células profesionales presentadoras de antígeno; si bien en sentido estricto solamente las células dendríticas son capaces de desempeñar estas funciones con la eficiencia necesaria para iniciar una respuesta inmunitaria a partir de linfocitos sin experiencia antigénica previa.
Las moléculas MHC de clase I, en una situación normal, se unen a péptidos derivados de proteínas propias (traducidas en la propia célula) que son degradadas en el proteasoma y, en el caso de una infección por un parásito intracelular (p. ej. virus, ciertas bacterias), absorben a péptidos derivados del patógeno. En ambos casos los péptidos (endógenos o microbianos) derivan del procesamiento citosólico del antígeno. Los péptidos resultantes de la degradación proteasómica son transportados al retículo endoplasmático rugoso (RER) para unirse a moléculas MHC de clase I recién formadas y que finalmente se exportan a la superficie celular a través del aparato de Golgi50,52,53.
Las moléculas MHC de clase II se unen a péptidos derivados de antígenos exógenos, que previamente han sido captados por la célula presentadora mediante endocitosis o fagocitosis y se han proteolizado en fagolisosomas. Los péptidos exógenos se adsorben a las hendiduras de las moléculas de clase II que habían estado protegidas de la unión a péptidos durante su biosíntesis por el péptido CLIP de la cadena invariante54.
Por tanto, existen dos tipos de rutas independientes para el procesamiento antigénico: la ruta citosólica y la ruta endocítica51. De acuerdo con estos paradigmas una célula profesional presentadora de antígeno solamente podría presentar antígenos microbianos asociados a moléculas de clase I y por tanto reconocibles por linfocitos T citotóxicos, si ella misma está experimentando la traducción de proteínas del parásito intracelular. En otras palabras, si está infectada por el germen.
La primera evidencia de que debían existir fenómenos de transferencia antigénica entre células de la economía y células profesionales de la presentación antigénica tuvo la autoría de Michael Bevan55,56. En sus experimentos de transferencia de células hematopoyéticas idénticas en antígenos principales de histocompatibilidad (y por tanto en las moléculas presentadoras de clase I) podían inmunizar frente a antígenos menores de histocompatibilidad, derivados de variaciones en secuencias peptídicas de las proteínas codificadas por variantes alélicas en la misma especie presentes en células inyectadas. Sus experimentos concluyeron que células del receptor podían activar al sistema inmunitario presentando de modo subrogado los antígenos menores de histocompatibilidad presentes en las células del donante. El péptido presentado en estos experimentos es del donante mientras que la molécula de MHC presentadora es del receptor. El fenómeno recibió el nombre de activación cruzada (crosspriming) puesto que el resultado de la presentación antigénica era la activación linfocitaria (o priming) antígeno-específica. Ya se ha comentado que el resultado de la presentación antigénica puede ser tanto la activación como la represión de respuesta inmunitaria frente a un antígeno. En el caso de la presentación cruzada hablamos de crosspriming o crosstolerance, según sea el resultado funcional sobre los linfocitos específicos de antígeno. Hemos elegido los términos castellanos presentación cruzada o presentación subrogada para traducir el vocablo inglés crosspresentation. Esto es así porque subrogación quiere decir en castellano la delegación o reemplazo en las obligaciones y funciones hacia otros. El resultado final es la presentación de antígenos capturados o «exógenos» en moléculas de clase I. Esto es lo que hacen las células dendríticas con antígeno derivado de otras células.
Aunque la mayoría de las CD son capaces de captar antígenos y presentarlos a las células T CD4+ vía MHC de clase II, la capacidad de procesar antígenos exógenos y presentarlos a células T CD8+ vía MHC de clase I parece que está más restringida. La presentación cruzada o subrogada es crucial para la generación de respuestas de linfocitos T CD8+ citotóxicos en respuesta a patógenos intracelulares57. Los linfocitos T citotóxicos son capaces de destruir células tumorales sobre las que reconocen el antígeno para el que son específicos y esto determina el intenso estudio de estos mecanismos58.
La presentación cruzada o subrogada es posible solamente en CD que muestran una adaptación de sus vías endocíticas para el procesamiento de antígeno57. Cuando una proteína o biopartícula es internalizada formándose endosomas, éstos frecuentemente se fusionan con lisosomas ricos en proteasas. En estos fagolisosomas la digestión proteolítica es usualmente muy activa, se potencia con el pH ácido (menor de 5) y es tan procesiva que no permite la formación de péptidos presentables por moléculas de MHC de clase I. Se piensa que en las células dendríticas el compartimento de los endosomas tempranos tiene peculiaridades que permiten el escape de polipéptidos al citoplasma, aunque no está bien aclarado qué mecanismo molecular es el que permite el acceso al citoplasma50. Se ha especulado con la baja actividad de las proteasas lisosomales por falta de acidificación, la inactivación de proteasas y la existencia de mecanismos de transporte activo en los que estaría implicada la proteína Sec2259. Aunque la naturaleza bioquímica de la lanzadera entre endosoma y citoplasma es por el momento desconocida, es objeto de de una intensa investigación. Una evidencia experimental muy elegante, aunque indirecta, que sugiere su existencia fue propuesta por J. A. Villadangos al demostrar que determinados subtipos de CD sufren apoptosis cuando se las pone en presencia del factor proapoptótico citocromo C60. Esta sustancia solamente activa la apoptosis cuando se encuentra libre en el citosoplasma. Por tanto la inducción de apoptosis en la célula dendrítica indica que estas células han permitido el paso de proteína intacta, que adquirida mediante endocitosis, alcanza el citoplasma60 (Fig. 1).
Las proteínas una vez liberadas al citoplasma son degradables por una proteinasa multicatalítica denominada proteasoma que está especializada en degradar polipéptidos no bien plegados y proteínas ubiquinadas. Experimentos con inhibidores del proteasoma han demostrado que es necesario un paso de digestión en este orgánulo citoplasmático para la presentación cruzada. Los péptidos producto de la digestión proteosómica son capturados por chaperonas que los transfieren a transportadores de péptidos selectivos (TAP-1/2) los cuales bombean los péptidos al interior del RER para ser cargados en moléculas de clase I que pueden anclarlas en su hendidura de unión (Fig. 1). Las células dendríticas carentes de TAP-1/2 no pueden presentar antígenos en moléculas de clase I y por tanto son incapaces de mediar presentación cruzada61.
El término presentación cruzada o subrogada se refiere a dos fenómenos potencialmente muy distintos entre sí. De un lado, la presentación de antígenos procedentes de la digestión de proteínas solubles endocitadas y, por otro lado, la presentación a partir de detritus celulares o restos apoptóticos habitualmente particulados62. Aun cuando la mayor parte de la experimentación se ha realizado con proteínas purificadas como antígenos modelo desde el punto de vista de la fisiología de la respuesta inmunitaria, la presentación de antígenos procedentes de células necróticas o cuerpos apoptóticos parece mucho más relevante. Aunque el fenómeno de presentación cruzada se puede observar con varios tipos de células dendríticas aisladas o diferenciadas en cultivo, existen subpoblaciones altamente especializadas en desempeñar estas funciones moleculares en un contexto relevante.
Esto es especialmente relevante si pensamos que el sistema inmunitario ha evolucionado para defender al organismo de parásitos intracelulares que destruyen a las células a las que infectan. Al morir las células infectadas dejarían entre sus restos antígenos relevantes del germen patógeno. Dependiendo del contexto microbiológico e inflamatorio, la presentación cruzada o subrogada puede dar lugar a una respuesta inmunitaria o a tolerancia antígeno específica. La inoculación de una proteína purificada sin adyuvante, daño celular o gérmenes tiende a inducir tolerancia, es decir falta de respuesta frente a ese antígeno. Además la relativa ineficiencia del fenómeno de presentación de antígenos traducidos por otra célula posibilita que antígenos de bajo nivel de expresión puedan ser ignorados por el sistema inmunitario sin inducción de inmunidad ni tolerancia en lo que se ha dado en denominar ignorancia inmunológica63.
Detección de patrones moleculares virales por células dendríticas especializadas en presentación cruzada o subrogada
La maduración de las CD es un programa de expresión génica cuyos productos determinan la capacidad de activar a linfocitos T y linfocitos NK. El programa madurativo puede ser inducido en respuesta a una lista de estímulos tanto microbianos como proinflamatorios. Estos pueden incluir patrones moleculares asociados a gérmenes, citoquinas pro-inflamatorias (ej: TNF-? e IFN de tipo I), inmuno-complejos y señales moleculares liberadas o generadas durante un daño tisular64-66. Los patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP) quizá son los estímulos más potentes y su descubrimiento ha ofrecido la posibilidad de desarrollar nuevos adyuvantes para vacunas64-66. Estos PAMP son reconocidos por receptores del sistema inmune innato denominados receptores de reconocimiento de patrones (RRP), que incluyen lectinas tipo C de superficie (CLR), receptores tanto de superficie como endósomicos tipo Toll (TLR) y receptores citosólicos como el RIG-I, MDA-5 y NLR64. Los receptores de reconocimiento de patrones moleculares de gérmenes se expresan en muchas células efectoras del sistema inmune innato, macrófagos, células dendríticas, y células B activadas, incluidas en el concepto de células presentadoras de antígeno33. No se trata de receptores específicos de antígeno, ya que no presentan una distribución clonal67, sino de detectores de la presencia de biomoléculas que denotan la presencia de gérmenes y la estirpe filogenética de los mismos.
Tras la infección de un virus, las células del sistema inmunitario tales como las CD y los macrófagos, detectan el ARN de doble cadena (dsRNA) viral a través de los receptores RLRs y TLR368. RIG-I y MDA5 pueden detectar los ácidos nucleicos de virus ARN en el citosol68. RIG-I detecta características del ARN de varios virus pertenecientes a los géneros de paramixovirus, ortomixovirus, flavivirus y rhabdovirus y MDA5 detecta ARN de picornavirus y calicivirus69,70. Tras la detección se activa un complejo con la proteína IPS-1 (también denominada MAVS) de la superficie mitocondrial y la activación de los factores IRF inductores de interferón tipo I, vía la tirosina quinasa TBK-132 e IKKe. TLR3 reconoce dsRNA en el interior de endosomas e inicia la transducción de señales a través de su dominio intracitoplasmático que interacciona con el adaptador TRIF69,70.
El ácido poliinosínico-policitidílico (poly I:C) es un análogo de ARN de doble cadena y el tratamiento de animales con poly I:C induce intensos efectos antivirales y antineoplásicos71, interpretados originalmente como el resultado de la producción de IFN-?. Las células dendríticas CD8?+ expresan los genes para IFN tipo I, IL-6, e IL-12p40 en respuesta a poly I:C. El poly I:C, actuando como una análogo de ARN viral, activa el eje RIG-I / IPS-1 en el citosol32,71. Poly I:C es agonista tanto de TLR-3 como de RIG-I, de manera que puede inducir la maduración de CD tanto desde endosomas fagocíticos como desde el citoplasma32,70,71. Dado que la misión fisiológica de los linfocitos T citotóxicos es la defensa frente a infecciones virales, parece lógico que la presentación cruzada se intensifique en presencia de ARN viral.
Subpoblaciones de células dendríticas de ratón especializadas en presentación cruzada o subrogada
Se reconocen tanto en ratón como en humano varias subpoblaciones de células dendríticas distinguibles por sus marcadores de superficie, su ontogenia y sus funciones72-74. En el bazo de ratón es posible realizar una división en dos subpoblaciones diferentes atendiendo al marcador CD8?. De esta manera, las CD se pueden clasificar en dos grandes subgrupos con distintas funciones biológicas: CD8?+/CD11c+ y CD8?-/CD11c+.
Las células dendríticas de la «familia CD8?+» representan aproximadamente el 20% de las CD convencionales del bazo en ratón75. Existe evidencia experimental in vivo que indica que estas células captan material exógeno para presentarlo asociado a MHC de clase I, lo que permite respuestas T citotóxicas frente a virus y tumores72,74,76. Asimismo, expresan receptores de membrana que les permiten internalizar eficientemente material de células muertas o en apoptosis77,78. Como sucede con otras poblaciones de CD las células CD8?+, en su estado inmaduro, expresan cantidades escasas de moléculas de co-estimulo, como CD80 y CD8679.
A diferencia de los linfocitos T citotóxicos que expresan el dímero CD8?/CD8ß, estas células disponen del homodímero CD8?/CD8?80, que es un co-receptor que interacciona con moléculas MHC de clase I pero su función en CD es desconocida y no se conserva en humanos.
En ratón se ha descrito la subpoblación CD8?+ localizada en sangre y en órganos linfoides secundarios y la subpoblación CD103+ en la dermis75,81 (Fig. 2 y Tabla 1). Ambas poblaciones expresan marcadores comunes (tales como Clec9a) y dependen para su ontogenia del factor de transcripción Batf382,83. Los ratones modificados genéticamente que carecen de este factor de transcripción carecen de células dendríticas CD8?+ en el bazo y en los ganglios linfáticos, mientras que los números de otros subtipos de CD se mantienen intactos. La ausencia de Batf3 conlleva que los ratones tengan una respuesta más débil frente a infecciones virales y una mayor incidencia de tumores espontáneos82,83. Además de la necesidad del factor de transcripción Batf3 para la diferenciación de las CD de ratón, se ha observado que la carencia del factor de transcripción IRF-8 determina la ausencia en el ratón tanto de células dendríticas plasmocitoides como de células dendríticas CD8?84. Existe además una cepa de ratón llamada BXH2 que porta una mutación puntual en el gen de IRF-8 y que determina la ausencia de las células CD8?, mientras que las CD plasmocitoides son aparentemente normales85.
Es muy sorprendente que las células CD8?+ de ratón residen en órganos linfoides sin patrullar los tejidos periféricos como la piel y las mucosas. El paradigma de la captura de antígeno en el tejido y subsecuente presentación linfocitaria en órganos linfoides no parece por tanto posible con esta distribución tisular. Existe un debate en la comunidad científica sobre el mecanismo que hace llegar aquellos antígenos que van a ser presentados hasta el órgano linfoide secundario. Es posible que ocurra presentación antigénica de segunda mano y que las células CD8?+ estén especializadas en presentar antígenos capturados por otras CD o macrófagos que sí provengan de focos inflamatorios86,87. La función de estas células CD8?+ es crítica para la inmunización con conjugados de anticuerpos monoclonales frente a la proteína DEC-205 y antígenos modelo88.
La expresión selectiva en la superficie celular de la lectina Clec9a en este subgrupo de células dendríticas ha permitido usar este receptor como diana para dirigir antígenos tumorales frente a estas subpoblaciones de dendríticas, resultando en una inducción muy eficiente de actividad citotóxica frente a antígenos modelo y frente a antígenos tumorales88,89. La experimentación con este subtipo celular es difícil debido a la complejidad para purificarlas en número suficiente a partir de bazos de ratones. Es posible emplear una estrategia basada en la infusión de la citoquina sFlt-3L (fms-related tyrosine kinase 3 ligand) que permite expandir esta subpoblación en número suficiente de forma que se pueda purificar estas células por selección inmunomagnética para experimentar sobre ellas90.
Una alternativa que permite estudiar este tipo de células dendríticas es el cultivo de suspensiones celulares de médula ósea con la citoquina sFlt-3L91. Aunque el sFlt-3L es la única citoquina exógena añadida al cultivo, la diferenciación depende de trazas de GM-CSF producido endógenamente92. Una fracción de las CD resultantes tienen propiedades funcionales similares a las células CD8?+ de bazo, aunque carecen de la expresión de CD8? en su superficie. Estas CD generadas en los cultivos expresan altos niveles de Clec9A y niveles bajos de CD172a, en comparación con las células CD8?+ del bazo. La estimulación de estas células con ligandos de receptores Toll-like (TLR), previa a la captura antigénica, incrementa en gran medida la eficiencia de la presentación cruzada93,94. Una serie de estudios publicados recientemente demuestran que los precursores circulantes del linaje de las CD8?+ no están dotadas de la capacidad de realizar la presentación cruzada de antígenos y que dicha capacidad se adquiere en pasos posteriores del desarrollo una vez desplegadas en el tejido linfoide75,78.
Por contraposición con el bazo, las células CD8?+ del timo representan la mayor parte de la población de dendríticas residentes en este órgano75. Las células CD8?+ residentes en el timo expresan Clec9A, CD205, CD24, así como CD11b y CD172a a niveles bajos. También expresan bajos niveles de moléculas de co-estímulo y niveles moderados de MHC clase II. Sin embargo, difieren en que expresan establemente CD10392. La molécula CD103 es un receptor de «homing» a tejidos epiteliales81,83. La importancia de la presentación cruzada en el timo es un tema en debate. Se puede especular que la captura y presentación de antígenos en restos apoptóticos de timocitos u otras células tímicas puede ser importante en fenómenos de selección negativa implicados en eliminar del repertorio de reconocimiento a linfocitos T citotóxicos con capacidad autorreactiva. No obstante, por el momento no se dispone de evidencia experimental.
El hecho de que las células de la «familia CD8?+» sean aquellas que parecen tener más acentuada esta capacidad, no significa que las células CD8?- no sean capaces de realizar la presentación cruzada en ninguna circunstancia62. Existen estudios experimentales que indican que se puede conseguir presentación cruzada por parte de la subpoblación CD8?- mediante su activación a través de TLRs o FcR95-98 y se ha observado que son necesarias para la presentación cruzada de antígenos derivados de Saccharomyces cerevisae99 (Tabla 1).
Las células dendríticas CD11c+ derivadas de suspensiones de médula ósea en cultivos de diferenciación en presencia de GM-CSF son capaces de presentar antígenos proteicos o en cuerpos apoptóticos fagocitados a linfocitos T citotóxicos con efectos terapéuticos frente a tumores100 (Tabla 1).
Las células de Langerhans (Langerina+ CD11c+) en la piel están desplegadas en la epidermis donde pueden capturar antígenos y se sabe que son capaces de migrar a ganglios linfáticos con material celular endocitado. Existen estudios experimentales en los que estas células demuestran capacidad de presentar a linfocitos T citotóxicos en particular en infecciones experimentales con virus HSV-181 (Tabla 1).
Muy recientemente se ha descrito un ratón transgénico Knock-in que va a ser de extraordinaria utilidad en el esclarecimiento de la fisiología de estas células profesionales de la presentación cruzada. En estos ratones se ha insertado en el locus del receptor de quimioquinas XCR1 el gen de una proteína fluorescente fusionada con el receptor de toxina diftérica. Este ratón permite realizar experimentos de seguimiento de estas poblaciones celulares que son selectivamente fluorescentes y deplecionar transitoriamente al ratón de estas poblaciones celulares mediante la administración de toxina diftérica a bajas dosis. Los experimentos realizados en estos ratones tras depleción confirman que desaparecen selectivamente durante 2-4 días las células CD8?+ del bazo/ganglio y las células CD103+ de la piel. En esas condiciones se confirma el papel crítico y no redundante de estas CD en la inducción de linfocitos T citotóxicos101.
Células dendríticas humanas especializadas en presentación cruzada o subrogada
Durante casi una década, el problema ha sido que no era posible identificar una población de células dendríticas humanas con características similares a las de las células dendríticas CD8?+ de ratón, ya que no existe una población que co-exprese CD8? y no es fácil obtener órganos linfoides humanos con viabilidad celular. Sin embargo, el trabajo del Dr. David Sancho, en el grupo del Dr. Caetano Reis e Sousa, permitió demostrar que existe una población con un perfil transcriptómico similar en humanos y en ratón89,102. Estos investigadores partieron de comparaciones transcriptómicas entre células CD8?+ de ratón con el resto de poblaciones dendríticas, identificando genes diferencialmente expresados. De entre estos genes, dos de ellos destacaban, puesto que debían expresarse en la membrana y era posible reconocerlos mediante anticuerpos monoclonales. Uno de ellos era la lectina tipo C, Clec9A (DNGR-1). Obteniendo anticuerpos anti-Clec9A fue posible identificar esta subpoblación en humanos y demostrar que en sangre periférica coincide con la previamente descrita por expresar el marcador BDCA-3 (CD141 o trombomodulina)103.
Recientemente, se ha confirmado que las células dendríticas BDCA-3+ humanas son funcionalmente equivalentes a las de la «familia CD8?+» de ratón102,104-107. En una primera descripción funcional se muestra que son superiores en su capacidad de presentación cruzada y en la generación de respuestas efectoras T CD8+ frente a antígenos exógenos102,106,107. Las células BDCA-3+ humanas comparten las siguientes propiedades con las células CD8?+ de ratón:
1. Expresan un patrón común de receptores: comparten la expresión de Clec9a (receptor de la familia 9 del dominio de tipo C de lectina)102,108, Necl2 (CADM1 o molécula 1 de adhesión celular)102,107, TLR-3107 y el receptor de quimioquinas XCR1104,109 (Fig. 2).
2. Dependen de los mismos factores de transcripción (Batf3, IRF-8).
3. Están especializadas en la captación de células necróticas.
4. Son productoras de IL-12 e IFN?110.
5. Tienen la capacidad de presentación cruzada o subrogada, lo que resulta potencialmente en la activación CTL.
La expresión selectiva del receptor de quimioquinas XCR1 sugiere un compartimento sumamente interesante en migración106,109. Solamente existe un ligando conocido, la quimioquina XCL1, que es producida por linfocitos T CD8 activados. De esta manera es muy posible que ambas poblaciones celulares estén hechas para encontrarse en el tumultuoso órgano linfoide en el que se mueven, de forma que la probabilidad de ejercer presentaciones cruzadas o subrogadas de antígeno es posiblemente superior a lo predecible por la escasez relativa de ambos subtipos celulares. Sin embargo, la capacidad para activar CTL de las células BDCA-3+ resulta quizá menos notoria que las células CD8?+ de ratón y necesitan ser inducidas por ligandos de TLR, como poly I:C102,111. Las células BDCA-3+ de sangre periférica podrían representar un equivalente de un linaje temprano de las células CD8?+ de ratón, para las que son necesarios factores adicionales para inducir eficientemente la capacidad de realizar la presentación cruzada de antígenos112. En trabajos posteriores se han identificado combinaciones de factores de crecimiento que permiten enriquecer en cultivo estas células pero con un bajo rendimiento/pureza y elevada complejidad metodológica113,114.
Existe controversia sobre si, en ausencia de activación, la población BDCA-1+, las pDC y las LC también son capaces de realizar la presentación cruzada de antígenos en el contexto de proteínas solubles. Todas estas poblaciones de CD tienen la capacidad de exportar proteínas internalizadas al citoplasma, paso clave para la presentación cruzada50. Estudios comparativos de células BDCA-1+ y BDCA-3+ aisladas de sangre periférica y de amígdalas demuestran que ambas tienen la capacidad de presentar antígeno exógeno a clones de linfocitos T en cultivo113. Es más cuestionable si las células BDCA-1+ son capaces de direccionar los antígenos internalizados a partir de restos celulares a endosomas tempranos y si esto permite su presentación cruzada o subrogada (Tabla 2).
Las células BDCA-3+ son las únicas que presentan la molécula Clec9A en su superficie, que resulta fundamental en el reconocimiento de las células necróticas para que pueda darse la presentación cruzada. De hecho, David Sancho pudo demostrar que el sistema Clec9A es necesario y no redundante para la captación de antígenos a partir de células necróticas en ratón115. Así, el receptor es crítico para poder presentar antígenos virales presentes en cuerpos apoptóticos como se demuestra en un sistema de infección por virus vaccinia116,117.
La endocitosis mediada por receptores puede ser también realizada a través de otras lectinas de tipo C. A este grupo pertenecen DEC-205, el receptor de manosa (MR), la dectina-1, DC-SIGN y DCIR28,118.
Steinman y su grupo identificaron que la función presentadora de antígeno de las CD estaba asociada con la expresión de DEC-205 (CD205), una proteína de membrana homóloga al receptor de manosa de macrófago, implicada en endocitosis119. La unión de la proteína a DEC-205 resulta en una rápida internalización a endosomas ricos en MHC de clase II. El papel de DEC-205 en la captación de antígeno y presentación cruzada se ha demostrado en CD de ratón120. DEC-205 se expresa en muchas subpoblaciones de CD pero cuando se hace diana un antígeno a DEC-205 mediante inmunoconjugados la única subpoblación que inmuniza a linfocitos T CD8+ es la subpoblación CD8?+. Es objeto de debate si estas observaciones dependen del hecho de que DEC-205 se internaliza a endosomas tempranos estables114. De hecho, las células BDCA-3+ tienen una mayor capacidad de realizar la presentación cruzada de aquellos antígenos dirigidos a endosomas tempranos, como se ha podido observar al utilizar un anticuerpo que señalice a través de DEC-205 conjugado con el antígeno114.
DC-SIGN fue originalmente identificado como un receptor de ICAM-3, que producía la proliferación de células T121. Este receptor es capaz de interaccionar con muchos patógenos, incluídos HIV, Mycobacterium y E coli122. Su papel en internalización de antígeno es objeto de controversia y no existe evidencia de su implicación en presentación cruzada.
Estrategias para la explotación terapéutica de células dendríticas profesionales de la presentación cruzada o subrogada
Las estrategias de inmunoterapia están comenzando a demostrar eficacia parcial en el tratamiento de pacientes con cáncer123-125. La inmunoterapia con células dendríticas se basa en aprovechar las propiedades de estas células para presentar antígeno de forma inmunogénica y así reprogramar y activar la respuesta de linfocitos T con capacidad tumoricida123,124,126. Actualmente, la tecnología más extendida de inmunoterapia frente al cáncer con células dendríticas consiste en inocular células extraídas del paciente, cultivadas in vitro, cargadas con antígenos tumorales relevantes, activadas (maduradas) para ser pro-inmunogénicas y reinfundidas en el paciente para inducir una respuesta inmune antitumoral.
El uso de la subpoblación de dendríticas humanas BDCA-3+, hasta ahora pobremente explorada en clínica, podría resultar en una respuesta efectora T citotóxica superior, como se ha demostrado con sus equivalentes murinos (Alfaro y col, manuscrito en preparación). Sin embargo por el momento no se ha podido generar ningún protocolo eficiente para separar o diferenciar con rendimiento razonable estas células a partir de sus precursores, aunque se ha realizado como ya hemos referido algún intento con escaso rendimiento113,114.
La eficacia en modelos de ratón y los conocimientos disponibles sobre las propiedades funcionales de esta subpoblación de células dendríticas indica que son las más apropiadas para la inducción de respuestas T citotóxicas frente a tumores y que por tanto resultarían en estrategias terapéuticas más eficaces. Existen dos aproximaciones posibles para inducir la respuesta a través de estas células dendríticas: (i) intentar dirigir antígenos al interior de estas células mediante proteínas de fusión dianizadas. Esta aproximación es prometedora pero, por el momento, presenta la dificultad de identificar que neoantígenos tumorales se pueden utilizar para la inducción de inmunidad antitumoral eficiente y (ii) proceder al aislamiento y manipulación de estas células ex vivo. Las células se purifican de los pacientes, se cargarían con antígeno tumoral para ser activadas (maduradas) y posteriormente se inyectarían por vía percutánea, intravenosa o en el interior de ganglios linfáticos localizados mediante ecografía.
La primera estrategia consiste en dirigir antígenos a receptores de la superficie celular específicos de las CD eficientes en captar antígeno para su presentación cruzada (DEC-205, CLEC9A). Por un lado, sabemos que la inmunización con antígenos dirigidos a la población homóloga CD8?+ de ratón es una estrategia efectiva para obtener inmunidad anti-tumoral127. La cuestión ahora es si se pueden realizar enfoques parecidos para dirigir antígenos al homólogo humano, alcanzando resultados terapéuticos significativos.
La segunda estrategia consiste en la selección de las células BDCA-3+ y su posterior manipulación ex vivo. Los pacientes se someterían a una leucocitoaféresis. Sus CD son separadas mediante inmunoselección, se cultivan en medios que contengan ciertos antígenos de interés y posteriormente se inyectan de nuevo al paciente. De la misma forma cabe mencionar el uso de sFLT-3L por su capacidad de multiplicar el número de células disponibles para su posterior aislamiento y manipulación, por lo que podría generarse un mayor número de células movilizadas con este método, lo que puede ser técnicamente necesario para hacer viable la estrategia. La inyección intratumoral de estas células es también una estrategia con posibilidades de éxito, sobretodo si se provoca la muerte de células malignas en el territorio de la inyección87. Parece plausible que las células dendríticas profesionales de la presentación cruzada elegirán, entre el debris celular, los antígenos tumorales más susceptibles de ser presentados128.
El tipo de agonista de TLR suministrado para inducir maduración también desempeña un papel muy importante en la calidad y el tipo de respuesta inmunitaria generada. Por ejemplo, la estimulación tanto con TLR3, TLR7 o TLR9 induce la producción de IFN tipo I, que permite mejorar aún más la presentación cruzada por parte de las CDs129. Del mismo modo, la estimulación con ligandos para TLR3, TLR4, TLR7 y TLR9 induce la producción de IL-12p7033. La estimulación de las células dendríticas mediante múltiples tipos de agonistas de TLR, en combinación unos con otros, parece ser uno de los medios más eficientes en la inducción de la maduración y en la estimulación de la presentación cruzada.
Es probable que la próxima generación de vacunas orientadas a conseguir linfocitos T citotóxicos explote las funciones especializadas de las células BDCA3+ y posiblemente incorpore formulaciones con diferentes tipos de ligandos de TLR como adyuvantes moleculares. El objetivo es una presentación cruzada muy eficiente inmunizando frente a los antígenos tumorales relevantes.
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